PCR仪校准方法进展

        PCR技术历经三代发展由定性转为定量，各类PCR方法对温度精确控制的要求越来越高，市场上各类PCR仪型号繁多，各生产厂家宣传的仪器参数指标差异较大，仅器长期使用导致性能下降，同一试剂在不同厂家仪器上使用对结果有所影响，无论是科学研究还是临床检验，仪器显示的温度、拷贝值、荧光等参数要实现真正意义的定性定量”，都需要进行量值统一和量值溯源。

        早期PCR的校准方法大多参照医药行业标准YY/T1173-2010《聚合酶链反应分析仪》，随着PCR技术发展及其应用领域扩大，目前PCR仪的主要校准依据为国家质检总局发布的JF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》”。该规范适用于模块加热的PCR仪计量性能校准，其他类型PCR仪可参照规范执行，规范中对定性PCR仪的温度示值误差、温度均匀度、平均升温速率平均降温速率提出计量特性要求，对定量PCR仪除此外多了样本示值误差和样本线性要求。所用温度校准装置由若干(通常15个)精密温度传感器、数据采集分析模块组成，可参照国家校准规范JJF1821-2020《聚合酶链反应分析仪温度校准装置校准规范》校准温度溯源量值:所用标准物质为国内外有证标准物质。

        相较国家校准规范JJF1527-2015对PCR仪的温度要求，地方校准规范JJF(浙)1124-2016《基因扩增仪(聚合酶链反应分析仪)校准规范》”进一步给出了热盖温度偏差、超调温度的参考技术指标;JJF(苏)222-2019《实时荧光定量PCR仪校准规范》2]提出了温度波动度、50℃和95℃的温度最大过冲量的性能要求;JJF(津)04-2020《实时荧光定量PCR仪校准规范》JJF(黔)60-2021《荧光定量聚合酶链反应分析仪校准规范》[4]对各校准点的温度最大过冲量均有要求:JJF(鲁)138-2022《实时荧光定量PCR仪校准规范》校准项目包含温度最大过冲量，但不设技术指标要求。各规范均现行有效，机构可根据客户要求，结合实际情况选用相应校准方法。

        PCR仪的定量功能依靠荧光检测系统实现JJF1527-2015使用标准物质，通过校准样本示值误差和样本线性，对荧光系统进行校准。但在实际校准过程中，使用生物标准物质的校准方法容易受人员操作、标物的解冻复冻储存运输条件荧光试剂、PCR检测板适配性及板型等诸多因素影响，现场校准存在一定难度。因此，计量技术机构开发了光学系统用于PCR仪物理项目和光学项目的校准，光学模拟器集成了温度传感器和发射光发生器两部分，发射光发生器可溯源直紫外可见分光光度计。各省荧光定量PCR均参照JJF(苏)222-2019《《实时荧光定量PCR仪校准规范》制定，光学部分主要是基于Ct值和熔解曲线。崔宏恩等人基于实时荧光定量PCR仪的熔解曲线，同时参考光学模拟器校准思路，开展了Ct值均匀度精密度、通道峰值高度一致性、线性灵敏度、熔解温度漂移和熔解温度比测试方法研究，为各实验室实时荧光定量PCR仪自校和质量控制提供有益参考。陈如冰等人提出一种基于光学模拟的荧光定量PCR仪校准方法，采用LED光源来模拟扩增时荧光强度的变化，可根据不同仪器或不同被测物来设置程序，以得到与实际用户样品“同类”的校准结果，具有较广的适配通用性。除JF(苏)222-2019外，JJF(津)04-2020、JJF(黔)60-2021、JJF(鲁)138-2022等校准规范均配备了光学模拟器，实际校准过程中光学物理方法和生化方法可根据客户要求二选一。

        鉴于数字PCR系统的扩增过程包括样品分散、样品热循环和样品检测，依据JF1527-2015仅对独立的温控系统进行校准无法完全反应仪器的真实性能，国家校准规范JF2055-2023《数字聚合酶链反应分析仪校准规范》已正式发布。该规范提供了温度示值误差、温度均匀性、升降温速率、拷贝数浓度相对示值误差、拷贝数浓度重复性技术指标，此外针对非芯片式数字PCR还提出了荧光强度重复性和反应单元数重复性的技术要求为数字PCR仪检测结果的准确性进一步提供保障。

        而对于恒温扩增核酸分析仪，部分省份已发布校准方法，如JJF(冀)200-2022《快速核酸检测仪校准规范》，JJF(吉)105-2022《快速核酸检测仪校准规范》等，国家校准规范征求意见稿也已出台。除温度项目外，地方规范和国家规范征求意见稿均要求了样本最低检出限和样本检测重复性，但评价方式各有差异，国家规范征求意见稿还给出了标准物质光强度检测重复性和光强度检测线性检测方法指导，对仪器性能评估更为全面。

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